重组 DNA的含义是什么?
重组 DNA的含义是什么?
重组 DNA的含义是什么?
重组 DNA的含义是什么?
①目的基因的获得.从细菌或动植物细胞中取出染色体的DNA,用内切酶将之切成若干片段,从中鉴定出目的基因.另一种方法是从细胞中分离到信使核糖核酸核(mRNA)用反转录酶的作用获得该基因的互补DNA(cDNA).如果预先知道某种蛋白质的氨基酸顺序,可以破译它的遗传密码,用DNA合成的方法获得基因.
②运载体的选择.运载体一般为质粒,是细菌中染色体以外的DNA.但它不是正常的成分,即没有质粒也完全可以正常生长.质粒是环状的DNA,能自主复制,有若干内切酶切口和某些抗生素的抗药性基因.可以作为转基因的载体.
③内切酶切割.将目的基因与质粒DNA如pBR322质粒,用相同的内切酶分别进行切割,结果它们都会形成相同的切口.
④连接酶连接.DNA连接酶,常用的有T4.在三磷酸腺苷(ATP)及镁离子存在的条件下,T4连接酶能将切口相同的两种DNA连接起来,形成一个插入目的基因的质粒,叫重组质粒.
⑤宿主菌.宿主菌如大肠杆菌作为受体菌,需要培养到旺盛生长阶段,叫感受态细胞.一般在液体培养基中,37℃振荡培养过夜即可.
⑥重组DNA的转化.将插入目的基因的质粒加入呈感受态的大肠杆菌中,同时加入适当的钙盐(Ca+2),振荡培养.大肠杆菌将重组质粒吞入胞内.这个过程叫转化.⑦转化子的筛选.pBR322质粒的PstI酶切口处插入目的基因时,则会破坏了抗氨苄青霉素的基因.将转化后的大肠杆菌单个菌落,挑取菌体分别接种于含氨苄青霉素及链霉素的培养基中.如在链霉素培养基上生长而在氨苄青霉素培养基上不能生长的菌落即为转化子.
重组DNA是指你的目的DNA片段与载体连接后的结构，载体常用的是质粒，载体有克隆载体和表达载体之分，克隆载体是可以大量复制你的目的片段，而表达载体是指可以表达你目的片段所对应的蛋白。