感受态的制备我制备的感受态加DMSO放-80最近转化率总是下降不知是什么原因,
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感受态的制备
我制备的感受态加DMSO放-80最近转化率总是下降不知是什么原因,
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氯化钙法（Calcium Chloride）
本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞,所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA
材料（MATERIALS）
缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）
（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)
冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution,ice cold)
培养基（Media）
用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）
LB agar plates containing appropriate antibiotic
核酸（Nucleic Acids）
质粒DNA （Plasmid DNA）
或经过重组的质粒（recombinant plasmid）
方法
1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落.把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中,于37°C下振荡培养过夜.2.转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）.
3.室温下,4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞.弃培养基,保留细胞沉淀.
5.加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液,并轻微打匀.
6.4°C下,4000 rpm离心10分钟收集细胞.
7.弃MgCl2-CaCl2 溶液,保留细胞沉淀.
8.加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液,并轻微打匀.冰浴放置若干小时为最好.
9.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作,也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏.
10.向事先灭菌,并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液.向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克).细心混匀管中成份.于冰浴放置30到40分钟.
11.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上,准确计时90秒.（此时不能摇动转化管）
12.把试管迅速转移至冰浴2到3分钟.
13.向每只试管中加入500微升LB肉汤.37°C放置45到90分钟,以使细菌复原,并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达.
14.转移适量体积（如果使用90毫米平板,一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有 相应抗生素的LB-琼脂平板上.
15.室温放置平板直到其上液体被吸收.
16.于37°C倒置平板培养.转化克隆应该于12-16 小时区间出现.