作业帮Western Blot为什么必须要用内参
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/05 11:26:42
Western Blot为什么必须要用内参
Western Blot为什么必须要用内参
Western Blot为什么必须要用内参
Western Blot
为什么必须要用内参
要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是
Western Blot
.
因为
Western
Blot
操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相
对变化.虽然,顺利的时候
Western
Blot
做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结
果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有
活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象
1+1
那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样
知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的.所以,严谨的
Western
Blot
实验设计中要求有
良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用.特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就
可以查出问题所在,
而不必抓耳挠腮怨天尤人.
良好的参照体系通常包括
分子量
Marker
（用来确定
蛋白条带对应的分子量大小）
,空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）
,
已知
量标准产物的正对照
；
另外还有
内参
.
可是由于经费限制或者偷懒的原因,
国内的不少人做
Western
Blot
往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析.
内参是最容易被忽略的一项.我们知道,要用
Western
Blot
比较不同条件下或者不同组织中,目的
蛋白表达量的相对多少,
前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础
.特别表达量不高时,上样
量误差就很可能影响结果的分析.所以你需要内参.
内参
即是内部参照（
Internal
Control
）
,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由
管家基因编码表达的
蛋白
(Housekeeping
Proteins)
,它们
在各组织和细胞中的表达相对恒定
,在检测蛋白的表达水平变化
时常用它来做参照物.在
Western
Blot
实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样
电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,
还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上
样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性
.
在国外发表的文章中,
Western
Blot
实验结果须进行内参校正已成为一种惯例.但是,国内仍有不
少科研人员在
Western
Blot
实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种
样品间上样量等同的唯一方法.然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确
定各种样品的准确蛋白浓度.如
UV
法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对
于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如
DNA
的干扰；且敏感度低,要求蛋白
的浓度较高.比色法测定蛋白浓度一般有
BCA
,
Bradford
,
Lowry
等几种方法.
BCA
法与
Lowry
法
都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰.
Bradford
法敏感度最高,
且与一系列干扰
Lowry
,
BCA
反
应的还原剂（如
DTT
,巯基乙醇）相容.但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的
标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性.另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上
样,此步骤也存在操作误差.
在
Western Blot
实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生
的误差进行校正.