设计实验从牛奶中分离蛋白质

设计实验从牛奶中分离蛋白质
设计实验从牛奶中分离蛋白质

设计实验从牛奶中分离蛋白质
从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/l.酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在,
胶粒直径约为20～800纳米,平均为100纳米.在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀,加工后可制得干酪或干酪素.本实验利用加酸,当达到酪蛋白等电点PH=4.7时,酪蛋白沉淀.脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清,在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白,还有溶解状态的乳糖,乳中糖类的99.8%以上是乳糖,可通过浓缩、结晶制取乳糖.
二、实验材料和试剂
脱脂乳或脱脂奶粉.
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7）,95%乙醇,乙醚,碳酸钙粉末,苯肼试剂.
三、实验步骤
1.从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉,再加入40ml40℃,PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml,
用PH精密试纸检验液体的PH值.静置冷却至室温,倾去上层清液（留作分离乳糖用）,剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中,用转速为2000转/分离心分离3～5分钟,倾出上层清液,（合并于上一清液中）,得酪蛋白粗品.于离心管中加入5ml蒸馏水,用玻棒充分搅拌,洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白,乳糖以及残留的缓冲溶液）,离心后弃去上层液,再用蒸馏水洗一次.于试管中加入5ml95%乙醇,充分搅拌,离心后弃去乙醇溶液,用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质.最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤,以除去脂肪类物质.将酪蛋白沉淀物凉干,称重、并计算得率.
2.从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中,加入1.5g CaCO3粉末,搅拌均匀后加热至沸.加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性,防止加热时乳糖水解,另方面又能使乳白蛋白沉淀.过滤除去沉淀,在滤液中加入1～2粒沸石,加热浓缩至3～5ml,加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭,搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾,趁热过滤,滤液必须澄清.加塞放置过夜,乳糖结晶析出,抽滤,用95%乙醇洗涤产品.
3.乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中,浓度约为5%,在试管中加入1ml乳糖溶液,1ml苯肼试剂①,摇匀,试管口用棉花塞住,在沸水浴中加热,并不时振摇,加热10～15分钟后,取出放置冷却,乳糖脎成结晶析出.取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态,可证实为乳糖.
①苯阱试剂有毒,小心使用,勿触及皮肤,如触及皮肤先用稀醋酸洗,再用水洗.
另外附上：
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性.所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎.常用的破碎组织细胞的方法有：
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎.常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等.
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎.
3.反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破.这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法.
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎.
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等.
(二) 蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来.抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定.如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等）,使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离.在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性.
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来.比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离.常用的有下列几种方法：
1.等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离.
2.盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出.被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性.
3.有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低.能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质.此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出.由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度.
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品.常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等.有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品