作业帮SOD活性怎么测
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/06 07:19:25
SOD活性怎么测
SOD活性怎么测
SOD活性怎么测
超氧化物歧化酶(SOD)的催化底物是O2 ,一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位.由于O2 自身很不稳定,且不易制备,测定SOD的方法除少数采用直接法外,一般多为间接法.
1．直接法 原理是根据O2 或产生O2 的物质本身的性质测定O2 的歧化量,从而确定SOD的活性.经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法(EPR)、核磁共振法.由于所需的仪器设备价格昂贵,一般较少应用.
2．一般化学法 这些方法的共同特点是要有一个O2 的产生体系和一个被O2 还原或氧化的可检测体系.在SOD存在下,一部分O2 被SOD歧化,因而O2 还原或氧化检测体系的反应受到抑制.根据反应受抑制程度,测定SOD的活性.一般化学法有邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法、没食子酸法、6-羟多巴胺法、亚硝酸盐形成法和碱性二甲亚砜法.
常用的有： (1) 邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法.原理是基于经典的分光光度法,在碱性条件下,邻苯三酚自氧化成红桔酚,用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm),同时产生O2 ,SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化,样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率,可反映样品中的SOD含量.本法具有特异性强,所需样本量少(仅50μl),操作快速简单,重复性好,灵敏度高,试剂简单等优点. (2) 细胞色素C还原法(McCord法)：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C,后者在550nm有最大光吸收.在SOD存在时,由于一部分O2 被SOD催化而歧化,O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少,即其反应受到抑制.将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线,由此计算样品中SOD活性.本法是间接法中的经典方法,但本法灵敏度较低.
3．化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下,催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸,同时产生O2 .后者可与化学发光剂鲁米诺反应,使其产生激发.SOD能清除O2 从而抑制鲁米诺的化学发光.本法可应用于SOD的微量测定,不仅灵敏度高,简便易行,而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似.
4．免疫学方法上述方法测定的是SOD活性,免疫学方法则可测定样品中SOD的质量,因此特异性较好,是较理想的测定SOD方法,免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等.但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原,对于检测不同种类的SOD,则须制备相应的特异性抗体,手续繁琐.
5．电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法.电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳.既可采用SOD活性正染色(呈现棕色区带)也可采取SOD活性负染色(呈现无色透明区带).根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小,对样品进行半定量分析,也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量.染色定位法常用于鉴定SOD,很少为了定量,主要原因是它不及化学法简便,但鉴定SOD却较化学法为优.用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白,有无同工酶,且可半定量地确定SOD的活性大小.
6.平行放在距20 W荧光灯管3 cm处的光照台上,光照8 min后,立即在200A分光光度计的460 nm波长下比色.用测得的结果计算样品中的SOD含量.
SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子,它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢.尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧,但体内 6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水.这样,三种酶便组成了一个完整的防氧链条.